液相色譜柱即使樣品和流動相已做過前處理，也仍難以完成避免柱子受到污染，因此必須對柱子行清洗。清洗應定期進行，如果在短期內分析許多樣品，則以每日清洗一次為宜，至少也應一周一次，防止有太多的雜質在柱上堆積。
反相柱的常規洗滌辦法是：分別取甲醇、甲醇-水各20倍柱體積（既對于一根4.6mmX25cm的柱來說，通常是50-60ml，而對于9.4mm內經X50cm的柱來說，通常是500-600ml） ，使之通過柱子。然后用流動相平衡（通常仍用20倍柱體積），柱一般將恢復正常。如果選擇性仍和以前不一樣，則表明還有其他雜質留在柱子里，這時應考慮更加嚴格的清洗：先用20倍柱體積的水，再用相同體積0.05mol/L硫酸，后用流動相溶劑。酸洗常能洗下有機溶劑所不能洗下的剩余雜質。在低pH值下做長期（一天或更長）清洗是不適宜的，但50ml洗液以2ml/min的速度清洗25min，一般對健合相沒有損害。注意，強堿不能用來清洗任何微粒硅膠柱（不論是健合相還是非健合相），因為硅膠骨架會溶解。對于嚴重污染的反相柱，只能采用再生的方法。
液相色譜柱的清洗：
1、沖洗系統細節多，尤其注意緩沖鹽在開始實驗之前，我們需要沖洗并穩定系統，在實驗結束之后，我們也需要使用適當的溶劑沖洗并保護系統。
2、置換系統流動相需要沖洗多長時間其實我們很難用時間準確的說明這個問題，因為沖洗時間會受流速和柱體積的影響。
所以這里建議大家用沖洗體積來計算，由于液相系統中的管線和色譜柱都比較細，流速相對比較慢，所以流動相置換的過程是比較慢的，需要5~10倍以上的系統體積才能*置換原有的流動相（并非專業術語，僅做問題舉例），所以只用知道系統體積即可。
系統體積包含儀器管線體積和色譜柱體積，比如管線體積是1ml，色譜柱的空余體積是3ml，系統體積就是4ml，用至少5倍的流動相沖洗，也就是需要20ml，10倍體積相當于40ml。有了沖洗體積，結合流速，自然就能計算出到底需要多長時間才能把體系置換好，沖洗干凈，比如，流速1ml/min時，大概需要20~40分鐘才能*置換系統中原有的流動相。
3、實驗結束之后用什么溶劑保護體系溶劑的選擇取決于色譜柱的類型，比如反相體系，色譜柱的體系基本為C8、C18類的，甲醇和乙腈是比較合適的溶劑，只是注意乙腈不能長期保存在液相系統中，因為乙腈有聚合的問題；
若是正相體系，比如氨基柱、氰基柱等正相色譜柱，正己烷是比較合適的溶劑，如果是離子交換柱，用水沖洗體系即可。
4、如何沖洗緩沖鹽需要格外注意的是，緩沖鹽在有機相中是不溶解的，所以千萬不能用有機相直接沖洗緩沖鹽體系，否則鹽顆粒析出會堵塞管線和色譜柱，一定要有過渡。
這里建議分三個階段沖洗緩沖鹽體系：（1）用大比例水，小比例有機相沖洗一段時間，這樣可以保證順利的沖走大部分鹽；（2）加大有機相的比例再沖洗一段時間；（3）根據沖洗體積的計算，確保緩沖鹽已經*被置換了之后再改為100%的有機相沖洗一段時間。
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